DNA-Ligations-Rechner
Berechne die exakte Masse an Insert-DNA für eine optimierte Ligationsreaktion zur Maximierung der Klonierungseffizienz.
Reaktionsparameter
Gib Vektorgröße, Vektormasse, Insertgröße und Molverhältnis ein.
Benötigte Insert-Masse
* Stöchiometrische Menge für optimale Klonierung.
Klebrige vs. Glatte Enden
Verwende 3:1 für klebrige Überhänge. Erhöhe auf 5:1 oder 10:1 bei glatten Enden.
Empfohlene Ligations-Bedingungen Referenztabelle
| Ligationstyp | Empfohlenes Molverhältnis (Insert:Vektor) | Inkubationstemp. & Dauer | Dephosphorylierung nötig? |
|---|---|---|---|
| Klebrige Enden (Doppelschnitt) | 3 : 1 | 16 °C über Nacht OD. 25 °C für 10 Min. | Nein (Inkompatible Enden) |
| Klebrige Enden (Einfachschnitt) | 3 : 1 oder 5 : 1 | 16 °C über Nacht | Ja (CIP / rSAP empfohlen) |
| Glatte Enden (EcoRV, SmaI, etc.) | 5 : 1 oder 10 : 1 | 16 °C über Nacht OD. 20 °C für 2 Std. | Ja (Hohes Selbstreligationsrisiko) |
| TA-Klonierung (PCR-Produkte) | 3 : 1 | 14–16 °C über Nacht | Nein (T-Überhang-Vektor) |
Berechnungsmethodik & Formeln
Formel für Insert-Masse
Erhält das stöchiometrische Gleichgewicht basierend auf der Basenpaarlänge.
Gesamt-DNA Menge
Hält die Gesamt-DNA im Ansatz unter 200 ng pro 20 μL für maximale Transformationseffizienz.
Häufig gestellte Fragen (FAQ)
Welches Molverhältnis von Insert zu Vektor ist optimal? ▼
Ein Molverhältnis von 3:1 (Insert zu Vektor) ist der Standard für klebrige Enden (Sticky Ends). Bei glatten Enden (Blunt Ends) wird ein Verhältnis von 5:1 oder 10:1 empfohlen.
Wie wird die benötigte Insert-Masse berechnet? ▼
Insert-Masse (ng) = Vektormasse (ng) × [Insert-Länge (kb) / Vektor-Länge (kb)] × Molverhältnis.
Warum muss der Vektor dephosphoryliert werden? ▼
Das Entfernen der 5'-Phosphatgruppen von einfach geschnittenen Vektoren durch alkalische Phosphatase (CIP/rSAP) verhindert die Selbstreligation ohne Insert.
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